蘋果酸合成酶Glcb基因克隆及表達特性研究.pdf

1、結(jié)核?。╰uberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性傳染性疾病，結(jié)核桿菌被巨噬細胞吞噬后，在巨噬細胞內(nèi)轉(zhuǎn)為持留狀態(tài)，通過乙醛酸循環(huán)途徑獲取能量，維持其在宿主體內(nèi)的長期持留存在。蘋果酸合成酶（Malate Synthase，MS）是一由GlcB基因編碼而成，在乙醛酸循環(huán)途徑中的關(guān)鍵限速酶之一，對結(jié)核桿菌維持其持留狀態(tài)起決定性作用，因此本研究以這一關(guān)鍵酶為研究對象。
　　

2、本文以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，通過PCR反應(yīng)擴增該菌株的GlcB基因，并將測序正確的GlcB基因，克隆入原核表達載體pET-28a（+）中，取名為pET28-glcb。重組蘋果酸合成酶在大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達。本研究成功克隆表達了結(jié)核分枝桿菌H37Rv蘋果酸合成酶酶基因，最佳的誘導表達條件確定為在溫度為20℃，IPTG終濃度為0.6mM，誘導表達8h，GlcB蛋白表達量達到最大。以鎳離子螯合型瓊脂糖凝膠親和層析

3、柱純化異檸檬酸裂解酶重組蛋白，以含200mmol/L咪唑的洗脫緩沖液將目的蛋白洗脫下來，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，獲得了純度較高的MS重組蛋白。采用超微量分光光度計實時監(jiān)測418nm處光吸收值的變化來計算MS的酶活性。最終計算結(jié)果酶活性為6.6μmol/(min·mg)。
　　同時，采用Discovery Studio2.1模擬多肽與MS蛋白晶體（3S9I）進行分子對接，最終對接結(jié)果確定以下兩條七肽鏈，命名及氨基酸序列分別為：3號：