擬南芥miR393通過與ABA信號(hào)途徑互作調(diào)控種子成熟和萌發(fā)的機(jī)制研究.pdf

1、種子的休眠和萌發(fā)是植物生命周期中兩個(gè)重要的階段，同時(shí)也是影響作物生產(chǎn)的農(nóng)藝性狀。有研究表明，除了通過ABA和GA在種子中的平衡調(diào)控休眠和萌發(fā)之外，生長素也發(fā)揮了調(diào)控功能。miR393是植物中最為保守的miRNA家族之一，在擬南芥中其靶基因編碼生長素受體F-box蛋白TIR1/AFB家族(theTIR1/AFB Auxin Receptor，TAAR)。我們的前期數(shù)據(jù)顯示，miR393表達(dá)受到ABA調(diào)控，其靶基因調(diào)控種子萌發(fā)對(duì)ABA的敏感

2、性，但miR393是否參與影響種子成熟和萌發(fā)及相關(guān)機(jī)制目前仍知之甚少。
　　本研究以擬南芥miR393及其靶基因的各種報(bào)告株系及突變體為材料，探究miR393如何通過靶基因TIR1及相關(guān)激素信號(hào)途徑參與調(diào)控?cái)M南芥種子的成熟和萌發(fā)，獲得了以下主要結(jié)果:
　　1、擬南芥種子成熟和萌發(fā)過程miR393及其靶基因的表達(dá)模式
　　1.1、種子成熟和萌發(fā)過程miR393及其靶基因的組織特異性表達(dá)模式
　　采用MIR393 a

3、/b啟動(dòng)子報(bào)告株系pMIR393a/b:G US，突變型和野生型靶蛋白報(bào)告株系p TIR1:mTIR1-G US，pTIR1:cTIR1-GUS和生長素反應(yīng)報(bào)告株系DR5:GUS，對(duì)擬南芥不同時(shí)期莢果和吸脹的種子進(jìn)行GUS染色。結(jié)果顯示，MIR393b在種子成熟中期(StageⅢ)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，在后期StageⅣ表達(dá)減弱;MIR393a的轉(zhuǎn)錄在所檢測(cè)的幾個(gè)時(shí)期變化不顯著。cTIR1蛋白的表達(dá)在StageⅠ至stageⅢ受到明顯的轉(zhuǎn)錄后抑制，

4、而DR5表示的生長素反應(yīng)信號(hào)在成熟早期（StageⅠ-StageⅢ）較強(qiáng)，至成熟后期GUS信號(hào)減弱。
　　在種子吸脹過程中，miR393的表達(dá)有上升趨勢(shì)，pMIR393a的轉(zhuǎn)錄集中在子葉和胚根，pMIR393b則主要在子葉中轉(zhuǎn)錄，miR393的積累與DR5:GUS表達(dá)的位點(diǎn)相互重合; CTIR1在于種子和吸脹種子中均有表達(dá)，隨萌發(fā)進(jìn)行有增強(qiáng)的趨勢(shì)，表達(dá)位點(diǎn)包括子葉近軸端和胚根延長區(qū)，根尖無表達(dá);而不受miR393調(diào)控的突變版本mT

5、IR1蛋白表達(dá)范圍更廣，GUS陽性部位擴(kuò)散至根尖，說明TIR1蛋白的積累受到miR393的抑制;TIR1蛋白積累的位點(diǎn)與DR5:GUS表達(dá)的位點(diǎn)在子葉中重合，在胚根中相斥。這些數(shù)據(jù)暗示miR393介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，對(duì)于種子成熟和萌發(fā)過程TIR1的空間分布及生長素反應(yīng)有一定的調(diào)控作用。
　　1.2、在種子成熟和萌發(fā)過程中miR393及其靶基因表達(dá)水平的變化
　　用野生型Col.0作為材料，對(duì)種子成熟和萌發(fā)過程中的miR393及

6、其靶基因進(jìn)行定量RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，在種子成熟過程中，miR393前體pri-MIR393b的表達(dá)水平先升后降，靶基因TIR1，AFB2和AFB3表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，說明在種子成熟后期，miR393及其靶基因逐步關(guān)閉功能;在種子吸脹過程中，隨著種子開始萌發(fā)，miR393及其靶基因的表達(dá)均明顯上調(diào)。說明在種子成熟和萌發(fā)過程中，miR393的豐度與生長素反應(yīng)密切相關(guān)，其靶基因轉(zhuǎn)錄本的水平受到多種因素的影響。
　　2、擬南芥miR3

7、93通過與ABA途徑互作調(diào)控種子休眠
　　2.1、ABA處理影響miR393表達(dá)
　　用5μM ABA處理擬南芥Col.0種子1天，定量RT-PCR的結(jié)果顯示:ABA處理后，miR393和靶基因的表達(dá)均下調(diào)，說明ABA負(fù)調(diào)控miR393的表達(dá)。
　　2.2、miR393影響種子的初生休眠
　　以擬南芥野生型Col.0，miR393功能缺失突變體mir393ab，靶基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合株系35S:m TIR1，m

8、iR393功能抑制株系35S:MIM393作為實(shí)驗(yàn)材料，統(tǒng)計(jì)將剛收獲種子的萌發(fā)率和出綠率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與野生型相比，35S:mTIR1和35S:MIM393株系的萌發(fā)率顯著低于野生型。這說明miR393可能通過TIR1負(fù)調(diào)控種子的初生休眠。
　　2.3、miR393影響種子萌發(fā)和幼苗生長對(duì)ABA的敏感性
　　在合有不同濃度ABA的培養(yǎng)基中萌發(fā)種子，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率、出綠率和根伸長對(duì)ABA的敏感性。結(jié)果顯示，與野生型相比，3個(gè)突變體株

9、系mir393ab，35S:m TIR1和35S:MIM393的萌發(fā)率和出綠率均有顯著降低，而35S:mTIR1根伸長顯著降低，從而說明miR393負(fù)調(diào)控種子萌發(fā)和幼苗生長對(duì)ABA的敏感性。
　　2.4、miR393對(duì)種子成熟和萌發(fā)過程生長素和ABA信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　以擬南芥擬南芥野生型Col.0，35S:MIR393a，mir393ab，35S:mTIR1為材料，對(duì)種子成熟和萌發(fā)過程，生長素和ABA信號(hào)相關(guān)的基因

10、表達(dá)進(jìn)行了qRT-PCR檢測(cè)。對(duì)生長素信號(hào)相關(guān)基因ARF10的qRT-PCR檢測(cè)顯示:在種子成熟過程中，ARF10轉(zhuǎn)錄本水平呈先升后降的趨勢(shì)，在35S:mTIR1株系中ARF10在StageⅢ顯著增加，說明TIR1水平的提高，促進(jìn)這一時(shí)期ARF10的表達(dá)。在萌發(fā)期，ARF加轉(zhuǎn)錄本水平逐漸上升，在35S:mTIR1和mir393ab株系的干種子(DS)中，ARF10的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于野生型，但在萌發(fā)過程中，ARF10表達(dá)水平顯著上升，上調(diào)

11、幅度較大。
　　對(duì)ABA信號(hào)通路相關(guān)基因的qRT-PCR檢測(cè)顯示:在成熟中后期mir393ab突變體中ABI3和ABI4水平顯著高于野生型，在吸脹萌發(fā)后期(DAC1)35S:mTIR1突變體中ABI3和ABI4顯著高于野生型，暗示miR393可能通過TIR1調(diào)控種子成熟和萌發(fā)期ABI3和ABI4的表達(dá)水平。
　　總之，在種子成熟和萌發(fā)過程中，miR393通過自身的特異表達(dá)，抑制其靶基因TIR1的水平及空間分布，負(fù)調(diào)控種子的初